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Rubrik: Tagesberichte |
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Bessere Isolation und Identifikation von Phosphopeptiden Die Veredelung der Proteine erfassen | |
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Die Phosphorylierung ist eine wichtige Modifikation bei Proteinen, da sie in vielen Fällen die Funktion oder Aktivität eines Proteins kontrolliert. Von besonderem Interesse ist dabei auch, welche Proteine zu einem bestimmten Zeitpunkt phosphoryliert sind. ETH-Forscher konnten nun zeigen, dass zur Erfassung eines solchen Phosphoproteoms für sich allein keine der bekannten Isolationsmethoden der Peptide, also der Bruchstücke der Proteine, genügt. Die Arbeit erschien diese Woche in der Fachzeitschrift „Nature Methods“. Erst vor kurzem konnten Wissenschaftler derselben Forschungsgruppe eine neue Methode zur Isolation und Identifikation von phosphorylierten Peptiden beschreiben, welche die vorher bekannten Methoden ergänzt. Proteine sind meist mehr als eine Kette von Aminosäuren, die sich im Raum faltet. So werden sie häufig nach ihrer Rohproduktion von der DNA über die Boten-RNA zur Aminosäurekette noch veredelt. Eine wichtige solche Veredelung, die im Fachjargon auch als posttranslationelle Modifikation genannt wird, ist die Phosphorylierung. Dabei werden an bestimmte Aminosäuren Phosphatgruppen gehängt. Diese Modifikation wirkt sich auf wichtige biologische Prozesse wie Zellwachstum, Zellteilung oder Signalübertragung aus. Da die Prozesse sehr komplex sind, hat man ein spezielles Interesse, dass man den Phosphorylierungszustand nicht nur eines Proteins, sondern möglichst vieler kennt. Man will also den Systemzustand für diese Veredelung kennen. Eine solche Phosphoproteom-Analyse durchzuführen, erscheint auf dem Papier auch relativ einfach zu sein: Als erstes gilt es die Proteine einer Zelle zu sammeln und sie nachher mittels enzymatischen Verdau in Peptide zu spalten. Diese Aufspaltung geschieht, da Peptide im Massenspektrometer leichter und in grösseren Mengen identifiziert und quantifiziert werden können als ganze Proteine. Bevor aber das Massenspektrometer mit seiner angehängten Analysesoftware die Identifikation der Peptide erlaubt, muss man die phosphorylierten Peptide isolieren. Das heisst, man braucht eine Methode, die spezifisch die phosphorylierten Peptide von den nicht phosphorylierten abtrennt, dabei aber keine Unterschiede macht, an welche Proteine die Phosophatgruppen angehängt sind. Verschiedene Methoden, verschiedene Ergebnisse Genau hier ist aber ein Punkt, bei dem die Praxis von der Theorie abweicht. Denn es gibt keine solche Methode. Diese Hürde systematisch aufgezeigt haben nun die Doktoranden Bernd Bodenmiller und Lukas Mueller sowie ihre Kollegen der Forschungsguppe von ETH-Professor Ruedi Aebersold vom Institut für Molekulare Systembiologie (1). Ihre Arbeit erschien diese Woche in der Online-Version der Fachzeitschrift „Nature Methods“ (2). Für ihre Untersuchung verglichen die Forscher drei verschiedene, häufig verwendete Isolationsmethoden von Phosphopeptiden, eine chemische und zwei, die auf der Affinität zu Metallionen basieren. Analysiert wurden Proteine des Modellorganismus’ Drosophila melanogaster, die mit dem Enzym Trypsin zu Peptiden verdaut worden waren. Die Resultate zeigten, dass man mit derselben Methode mit grosser Zuverlässigkeit dieselben Phosphopeptide isolieren konnte. Verglich man aber die Methoden miteinander, so ergab sich, dass jeweils ein anderes Segment des Phosphoproteoms erfasst wurde und entsprechend die einzelnen Segmente nur teilweise überlappten. So traten bei einer massenspektrometrischen Analyse von 19'000 erfassten, als relevant erachteten Signalen nur 500 nach allen Isolationsmethoden auf.
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Aus diesem Befund schliessen die Wissenschaftler, dass eine einzelne Isolationsmethode nicht genügt, um eine vergleichende Analyse des Phosphoproteoms durchzuführen. In einer Medienmitteilung der Nature Publishing Group meint der Autor, dass diese Warnung der Forschergemeinde helfen soll, die Vorhersagekraft einer bestimmten Methode nicht zu überschätzen. Löslichkeit als Lösung Doch auch die einzelnen Methoden für sich, sind nicht ausgereizt. Vor allem die Quantifikation ist anspruchsvoll, da phosphorylierte Peptide häufig in niederen Konzentrationen auftreten. Zur Verbesserung der Situation bei der Methode, die auf einer chemischen Bindung beruht, hat aber erneut die Aebersold-Gruppe vor kurzem einen Beitrag in „Nature Methods“ geliefert (3). Die Wissenschaftler waren erfolgreich, indem sie erstmals bei einer Proteomanalyse lösliche Polymere verwendeten, um die Phosphopeptide zu binden und anzureichern. Das Binden an die Polymere und spätere Lösen war auch gekoppelt mit einer Markierung der Peptide. Das neue Vorgehen funktioniert unabhängig davon, an welcher bestimmten Aminsosäure eines Proteins Phosphatgruppen angehängt werden. Phosphorylierungen an allen drei entsprechenden Aminosäuren Tyrosin, Serin und Threonin werden also erkannt. Mehrere Methoden parallel verwenden Um noch spezifischere Informationen zu erhalten, ergänzten die Forscher die Methode noch um einen weiteren Schritt. Mit Hilfe von Antikörpern gegen Tyrosin wurden Peptide mit dieser Phosporylierungsstelle angereichert. In menschlichen Abwehrzellen konnten dann auf diese Weise 75 Tyrosin-Phosporylierungsstellen und 80 Serin/Threonin-Phosporylierungsstellen identifiziert werden. Zudem gelang es, Veränderungen im erfassten Phosphoproteom, die durch eine spezielle Behandlung der Zelle hervorgerufen wurde, qualitativ und quantitativ zu verfolgen. Insgesamt ist für Ruedi Aebersold klar: Die einzelnen Methoden können für sich optimiert werden, bleiben aber weiterhin noch komplementär. Für eine möglichst komplette Analyse des Phospoproteoms müssten darum mehrere Methoden parallel angewandt werden. |
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Fussnoten:
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